Les personnages principaux de cette aventure seront toujours Hershel Layton, Luke Triton et Emmy Altava et cette fois-ci, ils devront se rendre à la ville de Monte d’Or où un homme mystérieux terrorise les habitants à l’aide d’un masque étrange nommé Masque du Chaos (qui, d’après les connaissances du professeur, donne un immense pouvoir à son porteur), en les changeant en pierre. Layton devra donc revenir à un épisode plutôt sombre de son passé, afin de résoudre les problèmes du présent. En effet, il sera possible de retourner dans le passé en incarnant le professeur âgé de 17 ans grâce à des flashbacks qui mettront notamment en scène les parents de Layton et ses amis d’enfance. Les autres nouveautés de Professeur Layton et le Masque des Miracles sont les animations et la modélisation des personnages en 3D, un mode de jeu flambant neuf qui permettra au joueur d’explorer d’anciennes ruines durant le passé du professeur, en évitant différents obstacles et ennemis, ainsi que trois mini-jeux inédits.